【求助】原始菌种的保存方法/微生物检测

3.2.2 液体石蜡保存法：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。1）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌HB101、大肠杆菌DH5a、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌O157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属；接种于半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。注：副溶血性弧菌接种于含盐的半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于室温。2）产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌：接种于CDC厌氧菌琼脂中，培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。3）酵母菌：接种于YPD培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。4）霉菌、白色念珠球菌：接种于PDA培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。5）链球菌属：接种于羊血琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。6)副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、脑膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。7）分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂36±1℃培养7天，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。

3.菌种保存。所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有本公司的检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法）；具体菌种保存方法如下：3.1 干粉菌种：购买的干粉菌种保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。3.2 斜面菌种或液体菌种：3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌种的长期保存，每种菌种保存5管。（1）准备用于液氮保藏的安瓿管或菌种保存管(塑料)，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。　　（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，121℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用121℃灭菌15分钟。　　（3）接入菌种：将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。　　（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。　　（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。　　（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。