我最近在做双荧光素酶实验pGreenII62-SK重组载体，用的是BamHI和XbaI酶切位点，重组质粒转化DH5a没有问题，提取质粒做了PCR和酶切验证，结果显示没有问题。但是转化EHA105一直不成功，麻烦大家帮我看看哪里出了问题。重组质粒测浓度大概在300ng/ul， 35ul感受态加3ul质粒 转化方法是冻融法（冰上5min，液氮5min, 37度水浴5min, 冰上5min）,加无抗YEB液体培养基震荡培养4小时，5000rpm 1min 弃上清反复吹吸重悬菌体沉淀 涂板子（rif 25mg/l kan 30mg/l），四天了还是没有菌落长出来。感受态是买的，转化过之前验证成功的亚细胞定位重组质粒，没问题；空转也可以长满板子。所以初步判断不是感受态的问题。师姐说可能有两个原因，一是没有转进去；二是载体丢失了卡娜抗性。我分析后觉得同样的转化方法亚细胞定位的载体可以转化成功证明转化方法没有问题，感受态细胞也没有问题，为什么会转不进去呢？重组载体在DH5a中也是用的卡娜抗性，没问题，所以应该也不是丢失了抗性所致。分析了很久，总结出以下几个问题希望做过的老师可以不吝赐教1. 是否需要pSOUP共转？我咨询的那个师姐没有用pSOUP，所以我觉得这个可能不是重要因素2. 农杆菌的种类是否会影响？我用的是EHA105，是不是需要用其他的，比如GV3101？3. 电转和冻融法影响大吗？点击转化需要重新买感受态吗？点击转化法和冻融法的感受态可以通用吗？