摘要： 利用酶解法降解 κ-卡拉胶，得到 κ-卡拉胶寡糖（KOS）。利用甲酰胺-氯磺酸和二甲基亚砜-甲醇-吡啶方法，分别得到 κ-卡拉胶寡糖磺化衍生物（SKO）和 κ-卡拉胶寡糖脱硫酸基衍生物（DSK）。利用单纯疱疹病HSV-1 研究了 κ-卡拉胶寡糖硫酸基含量与抗病毒活性之间的关系，同时从对病毒的直接作用、阻止病毒对细胞吸附、影响病毒复制和释放三个途径初步探讨了 κ-卡拉胶寡糖抗疱疹病毒的机理。实验说明 κ-卡拉胶寡糖硫酸基含量与其抗疱疹病毒活性二者呈正相关，而且 κ-卡拉胶寡糖及其磺化衍生物的抗病毒活性主要是通过阻止病毒对细胞的吸附而实现。关键词： κ-卡拉胶寡糖；酶解；磺化；脱硫酸基；单纯疱疹病毒Study on the relationship between the content of sulfate group and antiherpesviral activities of oligosaccharide from kappa-carrageenan卡拉胶(Carrageenan)是一种硫酸半乳聚糖，是存在于某些红藻细胞壁中的多糖成分。近年来的研究发现硫酸多糖往往具有独特的生物活性。卡拉胶作为一种结构独特的硫酸多糖，也被证明在抗肿瘤(Sugawara et al. 1982; Hoffman et al. 1995)、抗病毒(Witvrouw et al. 1994)、抗凝血(Opoku et al. 2006)、抗氧化(Yuan et al. 2006)等方面具有较理想的生物活性。作为一种高分子量化合物，卡拉胶因其相对分子质量过大而使应用受到限制。卡拉胶经降解后，生物利用度和生物活性能够显著提高。对实验制得的KOS、SKO、DSK的硫含量进行了测定。结果如表1所示。结果表明，本研究采用的磺化和脱硫酸基处理方法能够明显改变卡拉胶低聚糖的硫酸基含量，SKO的硫含量由7.5%增至24.2%；而DSK的硫含量则降低到2.05%。三种寡糖的硫含量有较大区别，有利于后续实验研究。 病毒感染细胞包括吸附、侵入、脱壳、生物合成、装配与释放。能够阻断病毒感染细胞的任何一个过程的药物，都可以成为抗病毒药物。目前关于卡拉胶抗病毒的研究较多，但就其抗病毒机理研究的都不是很透彻。例如，卡拉胶所带的负电荷能够结合 HIV-1 病毒带正电荷的特定区域，从而阻止病毒特定区域与细胞的结合；同时卡拉胶有抑制合胞体形成的作用，所以能够避免感染病毒细胞与未感染病毒细胞的结合。因此，卡拉胶才能够阻止艾滋病毒HIV-1 病毒对细胞的感染(Baba et al. 1990; Meshcheryakova et al. 1993)。卡拉胶抑制疱疹病毒的作用主要是通过阻止病毒吸附细胞而完成的，亦有研究发现卡拉胶可能能够抑制病毒的复制(Carlucci et al.1997; Duarte et al.2001)。有报道发现，只有将卡拉胶于病毒侵入细胞的同时加入，卡拉胶才能表现对病毒的抑制作用，卡拉胶抑制病毒复制是在病毒已经侵入细胞，但还未开始病毒蛋白复制的时候（Gonzalez et al.1987）。而本研究则表明，卡拉胶寡糖只具备抑制 HSV 病毒对 Vero 细胞吸附的作用，对病毒本身不具有灭活作用，也不能抑制病毒的复制和生物合成。因此，关于卡拉胶寡糖抗病毒的详细机理有待于进一步研究。KOS、SKO、DSK对HSV-1的直接作用结果如图5所示，对HSV-1病毒复制的抑制作用结果如图6所示。结果表明，κ-卡拉胶寡糖及其衍生物对HSV-1均无直接作用, 对HSV-1的复制也无明显作用。 KOS、SKO、DSK对HSV-1病毒吸附细胞的抑制作用结果如图7所示。结果表明，各个浓度的KOS、SKO对HSV-1病毒吸附Vero细胞有不同程度的抑制作用。在寡糖浓度为200μg/ml时，KOS的A值为0.53，SKO的A值为0.65，其抑制率分别达到38.3%和58.3%；在寡糖浓度为6.25μg/ml时，SKO的A值为0.48，抑制率仍达到30%，而KOS的A值为0.34，抑制率仅为6.7%。对于KOS和SKO，随着寡糖浓度的增加，对病毒的抑制作用也随之升高，表现出明显的量效关系。比较KOS和SKO对病毒的作用，相同浓度的SKO对病毒的抑制率要明显高于KOS。而DSK对病毒吸附细胞无明显抑制作用。 天然卡拉胶多糖因分子量大、粘度高、溶解度低等特点而影响其临床应用价值。若静脉注射未降解的卡拉胶，会与纤维蛋白形成不溶性复合物而难以被机体吸收利用。而经降解后得到的低分子量卡拉胶经静脉注射后可与血纤维蛋白生成可溶性复合物，则利于机体吸收，同时毒性也大大降低(Anderson et al. 1965)。相对于其他降解卡拉胶的方式，酶降解具有专一性、高效性、降解条件和过程易于控制、无副反应等优点。由于特定的降解酶只作用于特定的糖苷键，不但可以得到分子量比较均一的降解产物，并且对糖的主体结构也不会产生影响。除分子量的影响外，卡拉胶寡糖中的硫酸根数目也是影响其生物活性的重要因素。若去掉卡拉胶多糖上的硫酸根，则卡拉胶同时失去抑制 HSV 病毒的作用。有研究发现(Carlucci et al. 1997)，卡拉胶的抗 HSV 病毒活性与硫酸基团的含量直接相关，只有硫酸基团含量和分子量在合适范围的卡拉胶才能表现出强的抗病毒活性，卡拉胶的抗 HSV 活性会随其α-D-半乳糖 6-硫酸和 2,6-二硫酸单位环化成 3,6-内醚-α-D-半乳糖和 3,6-内醚--半乳糖2-硫酸残基而降低。本研究利用酶降解方法制得了 κ-卡拉胶寡糖，进一步通过化学方法得到 κ-卡拉胶寡糖磺化衍生物和 κ-卡拉胶寡糖脱硫酸基衍生物。从对病毒的直接作用、阻止病毒对细胞的吸附、影响病毒复制和释放三个途径进行了抗疱疹病毒实验。比较相同浓度寡糖对病毒吸附的抑制率，κ-卡拉胶寡糖明显低于 κ-卡拉胶寡糖磺化衍生物。硫酸半乳聚糖能够抑制多种被膜病毒，如艾滋病毒、疱疹病毒、囊膜病毒、沙粒病毒、粘液病毒和棒状病毒等(Witvrouw et al. 1994)。作为应用比较广泛的一种硫酸半乳聚糖，卡拉胶寡糖在药物开发方面具有良好的发展前景和使用价值。随着海洋药物和海洋保健生物制品的蓬勃发展，卡拉胶工业也将成为海藻工业发展的方向之一。