操作步骤如下:
1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子。将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
琼脂主要是从江蓠、石花菜、鸡毛菜、紫菜等红藻类海藻细胞壁中提取得到的多糖海藻胶。由于琼脂分子量大、溶解性差等缺点,大大限制了其应用。将琼脂进行适当处理,赋予其新的性能,是扩大琼脂应用范围的重要方法。目前,关于琼脂的深加工应用主要集中在利用琼脂提取琼脂糖和通过降解琼脂制备琼胶寡糖,而关于琼脂改性方面的研究,相对较少。因此,本文就琼脂的深加工研究进展进行综述,以期为琼脂在各领城的进一步应用提供参考。
琼脂深加工产品的制备方法
琼脂糖提取
琼脂糖,亦称琼胶素,是琼脂的重要组成成分,不含或含少量硫酸酯(盐)的非离子型多糖。琼脂糖的提取方法主要有碘化钠法、乙酰化法、聚乙二醇法、十六烷基氯化吡啶法(CPC)、二甲基亚砜法(DMSO)、EDTA-Na2法、DEAE-纤维素法、硫酸铵法、磷酸钠法、尿素法等。虽然方法不同,但最终目的都是将琼脂中的硫琼脂和琼脂糖分离,以纯化琼脂糖。关于各种提取方法,李龙和闫绍鹏已作了较详细的介绍。
琼胶寡糖的制备
琼胶寡糖,是琼脂经降解后形成的聚合度在2~10的低聚糖,由琼二糖的重复单位连接而成,具有优良的生物活性,如抗氧化、抗肿瘤、抑菌、美白保湿等功能。国内外对琼胶进行降解的方法主要有化学降解法和酶降解法。目前,国内外制备琼胶寡糖主要通过化学法和酶法降解琼脂而得到。
化学降解法
化学法制备琼胶寡糖主要包括酸降解、氧化还原降解和衍生化降解3种途径。其中,以酸降解法较为常用。采用稀酸,以盐酸和硫酸常见,通过直接加酸、逐级加酸或非均相等方法对琼脂进行降解,两种酸降解得到的产物有所不同。其中,盐酸降解的产物含较高的聚合度为3~8的寡糖含量,而硫酸降解的产物多为单糖和二糖。
毛文君等采用酸解法制备了一种包括琼三糖、琼五糖、琼七糖、琼九糖的奇数琼胶寡糖单体。通过酸降解法,于广利等也制备了一种聚合度为2~20的偶数琼胶寡糖醇单体,该单体不仅可以用于制备寡糖标准试剂,也能作为中间体进一步制备海洋寡糖药物或寡糖保健品。酸法制备琼胶寡糖工序较繁琐,需要经过中和、脱盐等处理,所得产物成分较复杂,工艺重复性差,而且酸解过程中容易引起糖结构的破坏,影响寡糖活性。此外,使用的化学试剂增加了废水处理成本。因此,学者们致力于寻找一种更高效经济的琼胶寡糖制备方法。
酶降解法
琼胶酶主要来源于微生物,通过微生物发酵,可以得到纯度较高的琼胶酶制剂。通过琼胶酶水解琼脂得到寡糖,是制备琼胶寡糖的一个非常重要的方法。与传统的酸降解法相比,酶法制备具有高效性和底物专一性,反应条件温和,产物纯度高,对环境无污染等优点。琼胶酶可分为a-琼胶酶和β-琼胶酶2种,二者水解琼脂得到的产物不同。a-琼胶酶作用于琼胶糖的a-1,3糖苷键,产物是以3,6-内醚-a-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖;β-琼胶酶作用于琼胶糖的β-1,4糖苷键,产物是以D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖。于文功等利用来自大肠杆菌重组株DHa-pET24-agaA的琼胶酶,发明了一种制备聚合度4、6的新琼寡糖的方法。此外,还利用由β-琼胶酶AgaB基因高效表达的大肠杆菌BL21(DE3)-pET24-agaB工程菌株所产的琼胶酶,水解琼胶糖得到聚合度不同的新琼寡糖。酶法制备琼胶寡糖具有较好的发展前景,但是由于酶制剂的规模化生产尚未成熟,产量有限,而且分离纯化技术仍在不断探索中,目前尚停留在实验室阶段。
琼脂在食品工业的应用中具有一种极其有用的独特性质。其特点:具有凝固性、稳定性,能与一些物质形成络合物等物理化学性质,可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、保鲜剂和稳定剂。广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、肉制品、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等等。
琼脂在化学工业、医学科研、可作培养基、药膏基及其他用途。
同时在进行生物实验时,在制作微生物的培养基的过程中,可以通过添加琼脂作为凝固剂来将液体培养基转化为固体培养基或半固体培养基。(加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便,通气问题易于解决,便于经常观察研究等。)